一、熒光定量PCR起源

熒光定量PCR（也稱TaqMan PCR,以下簡稱FQ-PCR）是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術，該技術是在常規PCR基礎上加入熒光標記探針來實現其定量功能的，與變通PCR相比，FQ-PCR具有許多優點。與普通PCR相比，FQ-PCR具有許多優點：1、封閉反應，無需PCR后處理。2、特異性強，靈敏度高。3、采用對數期分析，摒棄終點數據，定量準確。4、定量范圍寬，可達到10個數量級。5、儀器在線式實時檢測，結果直觀，避免人為判斷。6、可實現一管雙檢或多檢。7、操作安全，縮短時間，提高效率。熒光定量 PCR是 通過對 PCR 擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析。

熒光定量PCR分類：
☆TaqMan熒光探針
PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5‘-3‘外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。
☆SYBR Green熒光染料
SYBR Green是一種DNA結合染料，能非特異地摻入到雙鏈DNA中去。在游離狀態下，它不發出熒光，但一旦結合到雙鏈DNA中以后，便可以發出熒光。它的最大優點就是可以與任意引物、模板相配合，用于任意反應體系中。從經濟角度考慮，它也比其它的探針的價格要便宜得多。但由于它能與所有的雙鏈DNA結合，所以一旦反應體系中出現非特異擴增，那它就會影響到定量結果的可靠性與重復性。要避免這種不利因素，可以通過選擇良好的引物并優化反應條件以消除非特異性影響。

●主要實驗步驟如下：

RT-qPCR是由三個步驟組成:
1.反轉錄:依賴反轉錄酶將RNA反轉錄成cDNDA;
2.擴增:用PCR的方法擴增cDNA;
3.檢測:實時檢測和定量擴增的產物.

二、具體實驗操作步驟：

1.設計并合成Realtime PCR引物。
2.引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶進行含SG（SYBR?； Green）的PCR反應的優化。
3.客戶樣品RNA抽提
實驗對象為組織樣品，取適量（50-100mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），勻漿后抽提RNA。
實驗對象為細胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細胞，PBS清洗細胞，去PBS加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA 。
4.RNA質量檢測
a.紫外吸收測定法測定RNA在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，以計算其濃度并評估RNA純度 。
b.使用ambion公司的甲醛電泳試劑進行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性。
5.使用逆轉錄酶（Promega）進行反應，將樣品RNA逆轉錄為cDNA。
6.制備標準曲線樣品：
進行相對定量，需要先將樣品的目的基因以及管家基因進行PCR擴增，其產物進行梯度稀釋用于做標準曲線。
7.標準曲線樣品和待測樣品分別加入到含SG的RealTime PCR反應液中，進行RealTime PCR擴增和檢測。
8.檢測結果進行標準曲線分析：以對待測樣品的目的基因進行定量。相對定量實驗需要進一步用樣品的目的基因測得值除以管家基因測得值以校正誤差，所得結果代表某樣品的目的基因相對含量。
9.提供實驗報告：包括詳細的實驗方法及實時熒光定量PCR實驗結果的相關圖表 。

三、熒光定量PCR中的一些術語

1.CT值：熒光信號有統計意義顯著增長(即穿過閾值線)時的循環次數，或者說是從基線到指數增長的拐點所對應的循環次數。

2.閾值：閾值的默認設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍。

3.CT值與起始模板的量成線性關系。

四、主要儀器設備:

Sigma 3-18K高速冷凍離心機 德國Sigma公司

ABI ABI 7500熒光定量PCR儀 美國ABI公司

ZKU-B120超低溫冰箱 中國生命科技股份有限公司

Millipore 超純水系統 美國MILLIPORE公司

微量移液槍 Eppendorf公司

Bio-Rad核酸蛋白測定儀 美國Bio-Rad公司

五、客戶須知：

1、請您提供新鮮的且盡量多的材料，或直接提供純化好的總RNA或DNA（大于5ug/樣本）。如是如織：100－200mg

2、請通過EMAIL提供已知的全長基因序列。Email:huameixinan@163.com

3、請提供詳細背景資料：DNA/RNA來源，豐度。

六、結果提供：

1、實驗詳細步驟，和相關數據。

2、標準曲線，擴增曲線，溶解曲線。

3、完整的實驗報告（含軟件分析結果）

1、引物合成，費用全免。

2、免費提供3次重復的實驗結果。

3、引物和探針設計免費。

4、RNA抽提費用全免。

5、免費提供RNA保護試劑，上門服務取樣。

八、實驗完成時間：

30個工作日

九、威斯騰服務流程：

十、威斯騰生物服務項目：

分子生物學檢測	蛋白質與免疫學	動物實驗
實時熒光定量PCR	單克隆抗體制備	帕金森疾病模型
免疫共沉淀（Co-IP）	多克隆抗體制備	抑郁癥動物模型
ELISA（酶聯免疫吸附法）技術	Western-blot 實驗服務	脊髓損傷模型
生化指標檢測	蛋白雙向電泳實驗服務	腦外損傷模型
雙熒光素酶報告基因檢測	原核蛋白表達純化	骨神經損傷模型
染色質免疫共沉淀（ChIP）	真核蛋白表達純化	心肌缺血模型
GST pull Down	ITRAQ定量蛋白質組學	心力衰竭模型
	SLAC蛋白組學	肺動脈高血壓動物模型
		高血壓模型
病毒包裝純化	實驗課題整體外包	粥樣動脈硬化模型
過表達/干擾慢病毒包裝純化	整體課題外包	大腦中動脈阻塞模型
過表達/干擾腺病毒包裝純化	細胞整體實驗外包	慢性之氣管炎模型
逆轉錄病毒包裝純化	動物整體實驗外包	過敏性哮喘模型
腺相關病毒包裝純化		肺炎大鼠模型
		肝炎-肝硬化-肝癌模型
蛋白芯片	原代細胞培養	肝纖維化模型
細胞因子芯片	骨髓間充質干細胞培養	膽結石模型
生長因子芯片	脂肪干細胞培養	急性胰腺炎模型
信號通路磷酸化水平檢測芯片	心肌成纖維細胞培養	急性腎衰竭模型
BioPlex懸浮芯片	軟骨細胞培養	體內血栓模型
生長因子芯片	血管內皮細胞培養	關節炎模型
炎癥因子芯片	神經元細胞培養	I型和II型糖尿病模型
血管生成因子芯片	內皮組細胞原代培養	裸鼠成瘤
凋亡因子芯片		基因編輯動物
趨化因子芯片	電生理相關服務	動物整體實驗服務
HuProt TM 20K人類蛋白組芯片	膜片鉗實驗
細胞生物學	高通量測序	代謝組學
細胞原代培養	mRNA測序	氣相色譜GC/MS
MTT檢測	LncRNA測序	液相色譜LC/MS
細胞凋亡檢測	全基因組測序	核磁共震NMR
細胞周期檢測	RNA-Seq測序
細胞克隆形成實驗	外顯子測序	影像學相關實驗
Transwell細胞遷移/侵襲	16s擴增子測序	Micro-CT
流式分選	Small RNA測序	小動物活體成像
CCK8/XTT檢測	宏基因組測序	核磁共振
臺盼藍檢測細胞活性	單細胞測序	PET-CT
藥物篩選細胞學實驗	circleRNA測序
細胞粘附性檢測	甲基化測序	基因編輯動物
細胞劃痕實驗		條件性敲除小鼠/大鼠
細胞生物學整體實驗		全基因敲除小鼠/大鼠
細胞成管實驗
病理學檢測	CRISPR/Cas9細胞敲除/敲入	基因芯片
掃描電鏡	基因定點突變細胞系	LncRNA芯片
透射電鏡	單基因敲除細胞系	miRNA芯片
HE染色	多基因敲除細胞系	mRNA芯片
免疫組化	目的基因敲入細胞系	甲基化芯片（限人和小鼠來源樣本）
Tunel（原位末端凋亡法）檢測	報告基因敲入細胞系	SNP芯片（限人和小鼠來源樣本）
激光共聚焦	miRNA/LncRNA敲除細胞系
免疫熒光
Masson染色	CRISPR/Cas9動物敲除/敲入
原位雜交	基因敲除大鼠/小鼠
熒光原位雜交	基因敲入大鼠/小鼠
特殊染色（PSA、茜素紅、阿爾新藍等）
行為學檢測	藥物篩選服務項目	藥效學評價
水迷宮實驗	高通量自動藥物篩選平臺	神經系統藥物藥效學評價
曠場實驗	細胞高內涵藥物篩選平臺	抗腫瘤藥物藥效學評價
重復性刻板行為檢測	蛋白質組學靶標研發平臺	心血管系統藥物藥效學評價
動物跑臺檢測	分子藥理研究平臺	泌尿系統藥物藥效學評價
強迫游泳	生物膜片鉗藥物篩選平臺	內分泌系統藥物藥效學評價
	常規藥物體外篩選	抗炎免疫藥物藥效學評價

【本平臺合作項目】
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